La Transgénèse

Stage du 13 janvier 2005

 

Organisation : APBG.

Financement : IUFM.

Encadrement : Ecole de l’ADN de Nîmes (www.ecole-adn.fr)

Rédaction : Sylvie Dief

 

Les outils de la transgenèse.

 

Un gène est un fragment d’ADN double brin qui présente un brin codant transcrit dans le sens 3’ vers 5’ et qui produit de l’ARN dans le sens 5’ vers 3’.

 

La transgenèse nécessite de bien connaître les gènes que l’on veut transférer ou gènes d’intérêt. Elle a permis de mieux connaître brins transcrits et brins non transcrits, intron et exons.

On sait ainsi que le brin codant de différents gènes ne se situe pas toujours sur le même brin d’ADN.

 

                                                    Gène 1                  Gène 2

 

                                   5’                                                                               3’

 

 

                                                                                                                                            3’                                                                               5’

                                                                                                                          

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                    Brin transcrit

                                                                                                                      

                                                                                                                        Sens de transcription

 

Après avoir situé et délimité les gènes il faut les transférer sur un vecteur

 

1) Les différents vecteurs

 

a) Les plasmides

 

Il s’agit d’ADN bactérien allant jusqu’à 200 Kbases. Ce sont des outils de petite taille, faciles à bricoler et faciles à purifier.

En effet, on leur insère un ou plusieurs gènes de résistance à un antibiotique. La purification se fait alors par culture sur un milieu avec l’antibiotique en question.

 

 

                                                                Origine de réplication

 

                                                                                 Site d’insertion d’un gène à cloner

                                          G1

 

 

 

 

 

                                             

                                              G2

 

G1 et G2 sont deux gènes de résistance aux antibiotiques insérés pour faciliter la sélection.

Le site d’insertion du gène d’intérêt se situe sous l’origine de réplication et juste après un promoteur pour assurer qu’il soit bien transcrit.

 

Remarque : Les plasmides sont de bons outils mais présentent l’inconvénient de ne pas avoir une forme constante :

 

 


 

                        Forme relâchée          Forme linéarisée         Forme condensée

  

Ce qui entraîne des variations dans leur migration au sein d’un gel d’électrophorèse.

 

b) Les bactériophages

 

Ce sont des segments d’ADN simple ou double brin provenant de virus de bactéries.

 

c) Les cosmides

 

Ce sont des hybrides entre procaryotes et eucaryotes.

 

d) Les YAC

 

Ce sont des chromosomes de levure double brin. Ils permettent d’insérer des fragments très grands, de plusieurs Kbases.

 

2) Leur utilisation

 

Les vecteurs sont transférés dans des bactéries qui doivent présenter les 3 qualités suivantes :

  - être non pathogène.    

  - exprimer le vecteur.

  - être faciles d’entretient c'est-à-dire qu’elles doivent se développer sur un milieu simple.

 

La culture de ces bactéries OGM permet alors de produire en laboratoire une molécule donnée. On parle de clonage de molécule.

 

Le transfert dans les bactéries nécessite une fragilisation préalable de la paroi bactérienne.


 

Un protocole pour l’insertion de vecteurs PUC 18

dans une souche bactérienne.

 

PUC  18 est un plasmide qui présente une résistance à un antibiotique : l’ampiciline.

 

1 – Préparer un cristallisoir avec de la glace.

 

2 – Centrifuger dans deux tubes les bactéries 3 à 4 minutes à 3500 tours.min-1 dans leur milieu de culture.

 

3 – Vider le surnageant des deux micro tubes en le renversant au dessus d’une boite de déchets biologiques.

 

4 – Ajouter au culot des deux micro tubes 200 µL de CaCl2 à 50 mmol.L-1.

 

5 – Ajouter 10 µL de PUC 18 dans le micro tube n°1 et 10 µL d’eau stérile dans le micro tube n°2 qui servira de témoin.

 

6 – Vortexer vigoureusement pour resuspendre tout le culot.

 

7 – Incuber 15 minutes précises dans la glace

 

8 – Faire un choc thermique précisément de 90 secondes à 42°C sans agiter. Ce choc thermique n’accepte aucune variation ni de temps ni de valeur de température.

 

9 – Ré incuber dans la glace pendant 15 minutes.

 

10 – Ajouter 200 µL de milieu nutritif

 

11 – Etaler sur 4 boites de gélose avec ou sans ampicilline.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
En l’absence d’insertion de PUC 18 on observera un développement des bactéries sur milieu sans ampicilline et aucun développement sur milieu avec ampicilline.

En cas d’insertion de PUC 18 on observera un développement des bactéries OGM aussi bien sur milieu sans qu’avec ampicilline.

Le traitement ci-dessus a un rendement de l’ordre de 5 % ce qui permet d’attendre pour les boites de géloses les résultats suivants : 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Pour purifier l’ADN plasmidique, on prélève chaque colonie développée sur la première boite, on met en culture, on lyse pour récupérer les plasmides.